文献：细胞外囊泡交联剂构建具有应力松弛和生物活性蛋白修饰的水凝胶

链接：http://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC11388066/

作者：施禄丰， 景彦珍， 浩文路， 赵凡轩， 安梦莹， 金水灵， 长高， 戴永东， 朱银欣， 杨树旭， 张松英， 叶雪松， 蔡秀君， 王一凡， 辛尚敬

节选：

EV交联剂使蛋白质能够轻易地呈递至封装细胞

虽然EV交联剂中的生物成分可能不会直接影响封装的细胞，但使用EV交联剂形成水凝胶的另一个优势是它们能够将蛋白质呈递到整个水凝胶基质中。有效地将蛋白质封装在合成水凝胶中，同时保持其生物活性，这*具吸引力。[ 14 ]由于EV膜能够容纳多种功能性两亲分子，因此EV交联剂的功能性远超典型的多功能交联剂。[ 15 ]

在这里，我们展示了将两种不同的 DSPE-PEG 两亲分子顺序插入 EV 膜的潜力：DSPE-PEG-NHS 用于蛋白质结合，DSPE-PEG-SH 用于水凝胶交联（图 4 a-c）。使用牛血清白蛋白（BSA）作为模型蛋白，我们显示 BSA 带在凝胶带中向上移动，表明与 DSPE-PEG-NHS 结合后分子量增加，验证了 DSPE-PEG-BSA 的成功制备（图 4b）。我们还表明，用 DSPE-PEG-SH 和 DSPE-PEG-BSA 修饰的 EV 可以通过硫醇-烯光聚合成功与 8 臂 PEG-Nb 交联（图 4d）。然而，加入 DSPE-PEG-BSA 后，水凝胶的储能模量显着降低，表明蛋白质可能会干扰 EV 交联反应。为了进一步探索蛋白质呈递，我们使用绿色荧光蛋白 (GFP) 作为模型蛋白，以可视化其在水凝胶中的分布。荧光成像显示，GFP 均匀分布于 EV 交联水凝胶中，证实 GFP 已成功封装到水凝胶网络中（图 4e,f）。

图4

EV交联剂能够有效地将蛋白质递送到水凝胶网络中，同时保留蛋白质的生物活性。a）DSPE-PEG-蛋白质合成示意图，其中DSPE-PEG-NHS通过疏水相互作用与蛋白质偶联。b）BSA和DSPE-PEG-BSA的凝胶电泳结果，验证了DSPE-PEG-蛋白质的成功合成。c）示意图说明通过将DSPE-PEG-蛋白质和DSPE-PEG-SH与EV共培养形成SH-EV-蛋白质复合物。d）通过硫醇-烯光聚合使用SH-EV-BSA交联的水凝胶和流变测试显示通过PEG-SH和SH-EV-BSA交联的水凝胶的储能模量。 e、f) PEG-SH 和 SH-EV-GFP 交联水凝胶中的荧光图像和 GFP 荧光信号定量。比例尺，100 µm。g) SH-EV-VEGF 促进 HUVEC 聚集和发芽（血管生成指标）的分布示意图。h) 使用 TRITC Phalloidin 和 DAPI 染色，在第 5 天对 PEG-SH、EV-SH 和 SH-EV-VEGF 交联水凝胶中的 HUVEC 生长进行 Z 投影共聚焦图像。比例尺，100 µm。i) PEG-SH、EV-SH 和 SH-EV-VEGF 交联水凝胶中的血管芽长度和 j) 细胞簇分析。结果以平均值±标准差表示。在 d、f（ n = 3）中使用单尾非配对 t 检验进行统计分析，在 i、j（ n = 10-15）中使用单因素方差分析进行成对比较。

为了评估负载到 EV 交联剂上的蛋白质的生物功能，我们使用 VEGF 作为示例蛋白质，并将人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 封装在 SH-EV-VEGF 交联水凝胶中（图 4g）。培养五天后，虽然 HUVEC 在用 8 臂 PEG-SH 交联的水凝胶中保持圆形和隔离，但 EV 交联水凝胶中的细胞开始聚集，表明 EV 交联水凝胶的应力松弛特性允许细胞移动和聚集（图 4h-j）。值得注意的是，细胞簇在 SH-EV-VEGF 交联水凝胶中更为突出。有趣的是，我们观察到 SH-EV-VEGF 交联水凝胶中的一些细胞簇发芽实例，表明有血管生成趋势（图 4h-j）。在某些情况下，发芽几乎连接了两个独立的簇，验证了加载到 EV 交联剂上的蛋白质可以维持其生物功能并影响封装细胞的行为。

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