Ab-PROTAC偶联物是将PROTAC选定 性递送货到相关肿瘤神经元核膜的一款步骤。抗原-**偶联物（ADC）会将毒物非特异聊天地交换给**肿瘤神经元核膜，大系数下降毒副的功用。ADC还会不断增强曲妥珠单抗（Herceptin）或培妥珠单抗（Perjeta）等单克隆抗原的，尽管因ADC有着的片面性性（举例被非靶向药物肿瘤神经元核膜摄入），**仅仅只有个别ADC才能得到FDA报批。ADC發展受到的主要挑战与用量受限性毒素（DLT）有关系，即功用与脱靶毒素左右易于平横。ADC的另一类个问题是其实交换到中的**用量不大，这暗示着着**氧分子一定要有着**的肿瘤神经元核膜毒素，这有已经会引起毒副的功用。因PROTAC有着崔化性必将较低用量便可化学降解最终目标蛋白酶，故此PROTAC有已经是ADC的很理想负荷。
采取曲妥珠单抗-PROTAC偶联物就可以改变PROTAC的组织机构选定 性递送，并在HER2弱阳神经元核填入定 性分解塑料对方球蛋白。偶联物将几丁质酶朋友切合HER2/neu蛋白激酶，根据内吞流入神经元核后被溶酶体溶解保持出几丁质酶PROTAC（见图1A）。上述情况BRD4是慢性炎症和**症的自身靶标，探究了****神经元核建模中采用曲妥珠单抗和PROTAC偶联物改变几丁质酶朋友神经元核款式中BRD4分解塑料的潜质。
本文**选择BRD4降解剂MZ1的类似物PROTAC 1进行概念验证研究（图1B）。据报道100 nM MZ1处理细胞4小时后便可实现BRD4的完全降解，这种类型的PROTAC由BET的配体JQ1和VHL的配体组成。
**制订了通过叠氮和炔的环加成反应将PROTAC和曲妥珠单抗偶联的策略。利用化合物1的VHL配体部分上的游离羟基来结合叠氮端的PEG生成叠氮功能化的PROTAC，该羟基对于VHL的结合不可或缺，因此结合将PROTAC活性直到被溶酶体水解后才能生成活性的PROTAC。之后还原曲妥珠单抗的二硫键并与化合物13反应生成炔基功能化的曲妥珠单抗并将反应物在pH 8.5缓冲液中孵育过夜使其水解为具有血清稳定性的马来酰胺酸，后通过炔基官能化的曲妥珠单抗和叠氮-PROTAC 2之间的反应获得具有可控载荷和具有血清稳定性的Ab-PROTAC 3偶联物，从而确保了偶联物仅可通过酯基的水解释放PROTAC。Ab-PROTAC 3偶联物的合成由于没有采用铜（I）催化而排除了铜（I）的副作用。LC-MS分析显示了偶联物的成功合成，ELISA证实了抗体结合后活性仍完全保留。此外作者还是发现Ab-PROTAC 3具有稳定性：在37摄氏度pH 7.4的PBS中孵育4小时后仍有98.8％均保持完整结构，在孵育24小时后结构完整的偶联物仍高达83.5％（见图1E）。
基于细胞系中HER2/neu受体和BRD4的表达水平（见图2A、2B）和在测试相同条件下细胞系中游离PROTAC 1降解BRD4的能力（图2C），研究者选择了两种HER2阴性****细胞系（MCF-7和MDA-MB-231）和两种HER2阳性****细胞系（SK-BR-3和BT-474）来检测Ab-PROTAC 3的生物学活性。HER2 +和HER2-表型中，PROTAC 1对BRD4的降解差异性可能与细胞系中BRD4的表达差异有关。每种细胞系均用PBS、抗体（曲妥珠单抗）或阳性对照4（图2E）或不同浓度的Ab-PROTAC 3处理，并将BRD4降解剂4对BRD4的降解量作为阳性对照。认识到Ab-PROTAC 3在生理pH下稳定，作者在无血清培养基中用Ab-PROTAC 3处理细胞4小时或在处理1小时后将偶联物除去再培养23小时。
WB通过分析（图2D）得出结论Ab-PROTAC 3仅选性挥发HER2+細胞中的BRD4，而对HER2-細胞中的BRD4无会影响。用100 nM Ab-PROTAC 3处里細胞4 h，仅在HER2+細胞系中关注过了BRD4的完整挥发（50 nM还可以关注到BRD4看起来挥发），而在所有测评溶度下HER2-細胞系均未关注到挥发。然而，用Ab-PROTAC 3处里HER2+細胞1时间左右后弄掉Ab-PROTAC 3坚持孵育23时间左右也关注过了BRD4的看起来挥发，这得出结论偶联物在1时间左右的一年后已积极主动加入到HER2+細胞中并被溶酶体分析生产了使用量的PROTAC 1。随着Ab-PROTAC 3对丢失HER2/neu多巴胺受体外壁的細胞不可通过HER2/neu介导的内化，从而沒有关注到挥发。想必要注意，想用曲妥珠单抗处里細胞的所有科学试验中其未关注到BRD4挥发。某些科学试验报告验证了HER2/neu介导的抵抗能力-PROTAC偶联物能选性传达着PROTAC。
接下去来，进一大步科学探究Ab-PROTAC 3是不是能够淀粉酶酶体引诱BRD4挥发塑料，在便用/不便用淀粉酶酶体剂硼替佐米（BTZ）的现象下，将細胞与PBS、弱阳對照4或100 nM Ab-PROTAC 3孵育后将細胞裂解，WB展现了淀粉酶酶体剂可屏蔽这两种HER2+細胞系中Ab-PROTAC 3介导的BRD4挥发塑料（图2F）。
感觉介导的抵抗能力内化已完成不一样措施完成了密切调查，具有放射性记号、荧光电子显微镜探究、普鲁士蓝染色人体体生殖血血体肿瘤血内部核系术或人体体生殖血血体肿瘤血内部核系毒素测得。在其中，用荧光记号抵抗能力的共凝聚电子显微镜探究就能够对抵抗能力在不一样人体体生殖血血体肿瘤血内部核系区室（比如内体或溶酶体）完成wifi精确定位。原本有调查通讯报道用那样措施制定曲妥珠单抗的内化和人体体生殖血血体肿瘤血内部核系内区室化，证明怎么写HER2/曲妥珠单抗和好物的内体內化。充分注意到以上先例，写作者重要途径完成共凝聚电子显微镜探究调查活人体体生殖血血体肿瘤血内部核系中Ab-PROTAC 3的货运，以认定内化并举的一步解析构建在一起物在人体体生殖血血体肿瘤血内部核系内氛围中的必备条件。相对于以上调查，用了荧光记号的AlexaFluor488-Ab-PROTAC（AF488-3），将HER2 + SK-BR-3人体体生殖血血体肿瘤血内部核系与100 nM AF488-3孵育1半分钟后干洗人体体生殖血血体肿瘤血内部核系，并在1、4、8和24半分钟的时间段三维成像以调查和好物的货运（见图3A）。1 h时在人体体生殖血血体肿瘤血内部核系表面层探究到AF488-3，而在孵育4 h后AF488-3都已经 方面进到不一样的人体体生殖血血体肿瘤血内部核系阳台阳光房，差不多是中级证书和次级内体（图3A和3C）。8半分钟后AF488记号的区室与溶酶体密切共wifi精确定位（图3A和3C）；在找不到将构建在一起物过柱的必备条件下也探究已到形似的效果。溶酶体化解Ab-PROTAC 3后须缓解压力解离的可溶性PROTAC 1，第三进人体体生殖血血体肿瘤血内部核系核以才能够引发BRD4生物吸附。在同必备条件下呈现**品质的HER2感觉的MCF-7人体体生殖血血体肿瘤血内部核系不了摄取量AF488-3（图3B），这与以上人体体生殖血血体肿瘤血内部核系的BED4不能够被Ab-PROTAC诱导性生物吸附不符。
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