Ab-PROTAC偶联物是将PROTAC选取性递送往对应細胞的种手段。表面抗原-**偶联物（ADC）能否将渗透性活性聊天地传送给**細胞，大水平受限毒副目的。ADC还能否加强曲妥珠单抗（Herceptin）或培妥珠单抗（Perjeta）等单克隆表面抗原的，其实根据ADC自身的互补性性（举例子被非靶向疗法細胞摄入），**只是少部分ADC拥有FDA批复。ADC发展趋势遭受的重要挑战与含水量受限性渗透性（DLT）关于，即功能与脱靶渗透性当中未能发展。ADC的另外一只个不足之处是实际情况传送到中的**含水量不大，这暗示着着**原子核有必要含有**的細胞渗透性，这概率会诱发毒副目的。根据PROTAC含有催化剂的作用性从而较低含水量便可光降解任务球蛋白，以至于PROTAC概率是ADC的理想型负债。
首选曲妥珠单抗-PROTAC偶联物不错变现PROTAC的组织安排首选性递送，并在HER2抗体阳性癌内部核中首选性生物降解塑料工作目标核蛋白。偶联物将活性酶类聊天紧密联系HER2/neu肾上腺素受体，构建内吞进来癌内部核后被溶酶体可分解挥发释拉出活性酶类PROTAC（见图1A）。因其BRD4是宫颈炎症和**症的隐性靶标，深入研究了****癌内部核实体模型中采用曲妥珠单抗和PROTAC偶联物变现活性酶类聊天癌内部核类型、中BRD4生物降解塑料的能力。
本文**选择BRD4降解剂MZ1的类似物PROTAC 1进行概念验证研究（图1B）。据报道100 nM MZ1处理细胞4小时后便可实现BRD4的完全降解，这种类型的PROTAC由BET的配体JQ1和VHL的配体组成。
**制订了通过叠氮和炔的环加成反应将PROTAC和曲妥珠单抗偶联的策略。利用化合物1的VHL配体部分上的游离羟基来结合叠氮端的PEG生成叠氮功能化的PROTAC，该羟基对于VHL的结合不可或缺，因此结合将PROTAC活性直到被溶酶体水解后才能生成活性的PROTAC。之后还原曲妥珠单抗的二硫键并与化合物13反应生成炔基功能化的曲妥珠单抗并将反应物在pH 8.5缓冲液中孵育过夜使其水解为具有血清稳定性的马来酰胺酸，后通过炔基官能化的曲妥珠单抗和叠氮-PROTAC 2之间的反应获得具有可控载荷和具有血清稳定性的Ab-PROTAC 3偶联物，从而确保了偶联物仅可通过酯基的水解释放PROTAC。Ab-PROTAC 3偶联物的合成由于没有采用铜（I）催化而排除了铜（I）的副作用。LC-MS分析显示了偶联物的成功合成，ELISA证实了抗体结合后活性仍完全保留。此外作者还是发现Ab-PROTAC 3具有稳定性：在37摄氏度pH 7.4的PBS中孵育4小时后仍有98.8％均保持完整结构，在孵育24小时后结构完整的偶联物仍高达83.5％（见图1E）。
基于细胞系中HER2/neu受体和BRD4的表达水平（见图2A、2B）和在测试相同条件下细胞系中游离PROTAC 1降解BRD4的能力（图2C），研究者选择了两种HER2阴性****细胞系（MCF-7和MDA-MB-231）和两种HER2阳性****细胞系（SK-BR-3和BT-474）来检测Ab-PROTAC 3的生物学活性。HER2 +和HER2-表型中，PROTAC 1对BRD4的降解差异性可能与细胞系中BRD4的表达差异有关。每种细胞系均用PBS、抗体（曲妥珠单抗）或阳性对照4（图2E）或不同浓度的Ab-PROTAC 3处理，并将BRD4降解剂4对BRD4的降解量作为阳性对照。认识到Ab-PROTAC 3在生理pH下稳定，作者在无血清培养基中用Ab-PROTAC 3处理细胞4小时或在处理1小时后将偶联物除去再培养23小时。
WB探讨（图2D）反映出Ab-PROTAC 3仅选性光化学化学溶解HER2+癌内部核中的BRD4，而对HER2-癌内部核中的BRD4无印象。用100 nM Ab-PROTAC 3治理癌内部核4 h，仅在HER2+癌内部核系中洞察分析植物得到BRD4的完整光化学化学溶解（50 nM能够洞察分析植物到BRD4显著光化学化学溶解），而在其它试验浓硫酸浓度下HER2-癌内部核系均未洞察分析植物到光化学化学溶解。不仅，用Ab-PROTAC 3治理HER2+癌内部核1分钟后除开Ab-PROTAC 3仍在孵育23分钟也洞察分析植物得到BRD4的显著光化学化学溶解，这反映出偶联物在1分钟的期后已完全入驻到HER2+癌内部核中并被溶酶体拆解有了的用药量的PROTAC 1。是由于Ab-PROTAC 3对缺失HER2/neu多巴胺受体表面能的癌内部核不可来进行HER2/neu介导的内化，所以说无洞察分析植物到光化学化学溶解。都应该小心，想用曲妥珠单抗治理癌内部核的其它试验中其未洞察分析植物到BRD4光化学化学溶解。这样的试验导致证明文件了HER2/neu介导的免疫抗体-PROTAC偶联物能选性传达PROTAC。
下面来，进步科学探究Ab-PROTAC 3是否能够进行蛋清酶体帮助BRD4化学吸附，在在选用/不在选用蛋清酶体剂硼替佐米（BTZ）的情形下，将上皮細胞与PBS、呈阳性对应4或100 nM Ab-PROTAC 3孵育后将上皮細胞裂解，WB信息显示了蛋清酶体剂可抑制每种HER2+上皮細胞系中Ab-PROTAC 3介导的BRD4化学吸附（图2F）。
感觉介导的免疫抵抗能力内化已顺利实现的不一样手段来开展了普遍深入分析一下，包涵放射性图标、荧光体视电子显微镜、流式受损组织组织細胞膜术受损组织组织細胞膜术或受损组织组织細胞膜毒素判断。这其中，选用荧光图标免疫抵抗能力的共焦聚体视电子显微镜不错对免疫抵抗能力在的不一样受损组织组织細胞膜区室（列如 内体或溶酶体）来开展导航定位系统。原本有深入分析一下曝光选用这手段判别曲妥珠单抗的内化和受损组织组织細胞膜内区室化，事实证明HER2/曲妥珠单抗混合物的内自身化。选择到那些先例，作家意在顺利实现共焦聚体视电子显微镜深入分析一下活受损组织组织細胞膜中Ab-PROTAC 3的车辆装卸搬运，以证明内化相结那步分析一下联系物在受损组织组织細胞膜内场景中的问题。对那些深入分析一下，选用了荧光图标的AlexaFluor488-Ab-PROTAC（AF488-3），将HER2 + SK-BR-3受损组织组织細胞膜与100 nM AF488-3孵育1小時后洗條受损组织组织細胞膜，并在1、4、8和24小時的的时间影像以深入分析一下混合物的车辆装卸搬运（见图3A）。1 h时在受损组织组织細胞膜外观了解到AF488-3，而在孵育4 h后AF488-3就已经大部分进人到的不一样的受损组织组织細胞膜空间内，大要是中级证书和次级内体（图3A和3C）。8小時后AF488图标的区室与溶酶体普遍共导航定位系统（图3A和3C）；在没能将联系物洗刷的问题下也了解达到是类似的的最终。溶酶体化解Ab-PROTAC 3后须降低自由的特异性PROTAC 1，再进人受损组织组织細胞膜核以就要开启BRD4挥发。在一模一样必要条件下表达方法**情况的HER2感觉的MCF-7受损组织组织細胞膜未能摄食AF488-3（图3B），这与那些受损组织组织細胞膜的BED4不被Ab-PROTAC分析挥发保持一致。
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